Сюжет Resident Evil 5 розгортається в Африці, у вигаданому районі Кижуджу (Kijuju). Після падіння корпорації "Амбрелла" виробництво біологічної зброї не припиняється, а скоріше навпаки, набирає обертів. Для боротьби з біотероризмом був створений загін спеціального призначення BSAA (Bioterrorism Security Assessment Service), в якому складаються головні герої гри - Кріс Редфілд (герой Resident Evil, Resident Evil Code: Veronica і Resident Evil: Umbrella Chronicles) і його партнер по місії Шева Аломар. Корпорація TriCell, заснована на руїнах Амбрелла Альбертом Вескером, є одним з найбільших представників на ринку фармацевтичних продуктів (а також біо-органічного зброї, яке розробляється під цим прикриттям). План Вескера полягає в тому, щоб випустити смертельний вірус за допомогою виверження вулкана.

Продюсер гри Дзюн Такеуті, заявив, що геймплей RE5 такий же як і RE4. Гравець буде управляти персонажем Редфілда з-за плеча. Так само в грі з'являться нові доповнення роблячи гру по-справжньому реалістичною. Наприклад, якщо Кріс буде занадто довго перебувати на сонці, він почне бачити міражі і галюцинації. Так, у грі реалізовані різні світлові ефекти. Наприклад, якщо гравець перебував тривалий час у темному або світлому приміщенні і переходить з однієї області в іншу, то він втрачає зір на короткий проміжок часу, поки очі персонажа не адаптуються.